補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子的結(jié)構(gòu)及功

補(bǔ)體系統(tǒng)的激活為一種級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但受到多種調(diào)節(jié)分子的嚴(yán)格控制，其反應(yīng)的程度和單一成分的反應(yīng)都是在生物反饋近代制下而進(jìn)行的，從而限制了活化的擴(kuò)大化，以維持補(bǔ)體水平的平衡。調(diào)節(jié)作用包括兩個(gè)方面，即自身衷變失活及一些抑制物的滅活作用。前者指已活化的補(bǔ)體分子均不穩(wěn)定，如不及時(shí)與靶細(xì)胞膜結(jié)合即迅速衰變失活；后者是通過抑制物的作用而使已活化的分子失去活性。這一節(jié)中僅涉及后一個(gè)方面。

一、C1抑制物

C1抑制物（C1INH）是血清中高度糖基化的一種蛋白質(zhì)，含糖量高達(dá)35-49%。*初由Ranoff和lepow(1957)所發(fā)現(xiàn)，稱其為C1酯酶抑制劑，與引同時(shí)Schultze等則將其稱為α2神經(jīng)氨酸糖蛋白。C1INH為一單鏈分子，由478個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為104kDa，由478個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為140kDa，鏈內(nèi)有兩對二硫鍵（圖5-13）。C1INH調(diào)節(jié)的主要方式是，與活化的C1r或C1s結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物而導(dǎo)致C1絲氨酸蛋白酶失活。其作用機(jī)理是，C1INH通過提供一個(gè)酷似C1r或C1s的正常底物的序列為“銹鉺”（“bait”），被c 1r或C1s裂解暴露出一個(gè)活性部位，然后再與C1r或C1s結(jié)合形成共價(jià)的酯鍵而發(fā)揮抑制作用。此外，C1INH還可防止在缺乏抗體時(shí)，C1以很低但仍有一定速率出現(xiàn)的自發(fā)激活。正常情況下，血液中的大多數(shù)C1可被7倍于其克分子濃度的C1INH所結(jié)合，以防止C1由于構(gòu)象改變而引起的自發(fā)激活。但C1同抗原、抗體復(fù)合物的結(jié)合，可使C1從C1INH的抑制作用中而獲釋。除上述作用外，C1INH還可抑制凝血因子Ⅻa、Ⅺa、激肽釋放酶及纖溶酶，因而其在凝血、激肽和纖溶系統(tǒng)中也有重要的調(diào)節(jié)作用。

經(jīng)對C1INH cDNA序列的分析發(fā)現(xiàn)，C1INH與其它幾種絲氨酸蛋白酶抑制物（serpin）超家族成員（α1抗胰蛋白酶、α1抗糜蛋白酶及抗凝血酶Ⅲ等）約有30%的氨基酸同源性，物別是在C端的120個(gè)氨基酸。C1INH的編碼基因定位于第11號(hào)染色體的短臂11.2～長臂13亞區(qū)。C1INH先天性缺陷時(shí)，可導(dǎo)致遺傳性血管神經(jīng)性水腫（hereditary angioneurotic edema,HAE）。近年報(bào)道應(yīng)用C1INH濃縮劑防治HAE效果良好，但尚未廣泛用于臨床。

C1 INH分子的結(jié)構(gòu)模式圖

圖5-13　C1 INH分子的結(jié)構(gòu)模式圖

注：（a）為電鏡觀察模式圖

（b）為中子散射模式圖

（c）為園二色譜分析的二級(jí)結(jié)構(gòu)模式圖

二、C4結(jié)合蛋白

C4結(jié)合蛋白（C4bp）是一種含量豐富的可溶性血清糖蛋白，分子量為550kDa，1977年由Ferreira等所報(bào)道。其分子結(jié)構(gòu)模式現(xiàn)多以Dahlback等（1983）描述的“蜘蛛樣”（spiderlike）結(jié)構(gòu)來分析其結(jié)構(gòu)及功能。C4bp由8個(gè)亞單位組成，電鏡下觀察形似蜘蛛，其中有7條分子量相同（均為70kDa）的長鏈（α鏈），由549個(gè)氨基酸殘基組成，鏈間以二硫鍵相連結(jié)，并共同氨基酸殘基組成，鏈間以二硫鍵相連結(jié)，并共同連結(jié)于一中心體。α鏈含有8個(gè)SCR，其N端是其頭部，為與C4b相結(jié)合的部位，可能位于第332-395位氨基本酸殘基。第8條鏈（β鏈）較短（45kDa）由235個(gè)氨基酸殘基組成，含有4個(gè)SCR為與蛋白S（PS）相結(jié)合的部位（圖5-14）。C4bp以兩種方式抑制補(bǔ)體的活化。**種方式是，通過其與C2競爭C4b，而從c 4b2a中取代C2a，并通過其與C4b的結(jié)合而陰止剩余的C2同C4b結(jié)合，由此抑制C3轉(zhuǎn)化酶的形成。C4bp與C4b的結(jié)合能力與細(xì)胞表面C4b分子的數(shù)成正比，且較C2同C4b的結(jié)合能力高27倍。**種方式是，C4bp作為I因子的一種輔助因子，促進(jìn)I因子對C4b的裂解。有C4bp存在時(shí)，I因子可將C4b的a`鏈完全裂解；無C4pb時(shí)，I因子的裂解作用不完全。其與I因子結(jié)合的活性部位位于第177-322位氨基酸殘基區(qū)域。PS與C4pb的第8條鏈（β鏈）結(jié)合，不影響C4bp同C4b的結(jié)合，但可延長C4bp的半衷期，從而強(qiáng)化C4bp的抑制作用。

C4bp的結(jié)構(gòu)（模式圖）

圖15-14　C4bp的結(jié)構(gòu)（模式圖）

C4bp基因定位于人的第1號(hào)染色體長臂32區(qū)，同CR1、CR2、H因子、MCP及DAF等的基因相連鎖，并均含有數(shù)目不同的SCR。

三、促衰變因子（CD55）

促衰變因子（decayaccelerating factor,DAF）是Nicholson-Weller等（1981）用正丁醇提取后，再以層析法從人和豚鼠紅細(xì)胞基質(zhì)中純化的一種膜蛋白。因其具有促進(jìn)C3轉(zhuǎn)化酶衷變的活性故名。經(jīng)在還原條件下做SDS-PAGE并以過碘酸-Schiff試劑染色表明，純化的DAF為單鏈膜糖蛋白。人和豚鼠的DAF分了量不同分別為70kDa和60kDa。現(xiàn)已按白細(xì)胞分化抗原將其歸為CD55。Davitz等（1986）通過用磷脂酰肌醇（PI）特異性的磷脂酶C（PI-PLC）處理人外周血細(xì)胞可釋放DAF的事實(shí)探明，DAF是經(jīng)糖磷脂酰肌醇（glycosylphodphatidylinositol,GPI）錨而固定于細(xì)胞膜中的。即糖蛋白的C末端共價(jià)結(jié)合于含PI的糖磷脂上，再經(jīng)PI插入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的外層小葉中。研究表明，膜DAF的遷移率接近于膜類脂的遷移率，比大多數(shù)膜蛋白遷移率高一個(gè)數(shù)量級(jí)。認(rèn)為這有助于促進(jìn)數(shù)目有限的膜DAF分子與細(xì)胞表面大量的C3b或C4b片段接觸。另外DAF的糖磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)還可能具有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)的作用。

除Nicholson-Weller等證實(shí)的分子量為70kDa的膜DAF外，Kinoshita等（1987）用Western blotting在人紅細(xì)胞表面還檢出分子量為140kDa的一種膜DAF，稱其為DAF-2。DAF-2在膜上的數(shù)目不足70kDa膜DAF的1/10，但也有促進(jìn)C3b轉(zhuǎn)化酶衰變的活性，也含有GPI錨結(jié)構(gòu)。由于DAF-2的分子量較70kDa的膜DAF大一倍，提示其為膜DAF的二聚體，但用二巰基乙醇或以SDS使基變性，都不能將DAF-2裂解成兩個(gè)成分，故DAF-2的**結(jié)構(gòu)仍有待進(jìn)一步闡明。另外，近年應(yīng)用兩位點(diǎn)RIA測定法，在血漿、尿液、淚液、唾液、滑膜液和腦脊液，以及組織培養(yǎng)上清中均檢出可溶性的DAF（sDAF），水平的40-400ng/ml范圍。并發(fā)現(xiàn)尿液中的sDAF分子量略低于紅細(xì)胞上膜DAF的分子量，疏水性也較膜DAF小，其抑制細(xì)胞表面C3轉(zhuǎn)化酶內(nèi)在裝配的活性較膜DAF約低100倍，但仍具有促進(jìn)已形成的C3轉(zhuǎn)化酶衰變的作用，效能類似于C4bp。

膜DAF廣泛分布于各種血細(xì)胞及其他各處的細(xì)胞上，包括紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、**細(xì)胞（T、B）、血小板、骨髓單個(gè)核細(xì)胞、紅細(xì)胞的始祖細(xì)胞，角膜、結(jié)合膜、消化道粘膜、外分泌腺、腎小管、膀胱、**粘膜、胞膜、心包及滑膜的上皮細(xì)胞，精子，以及培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上。但NK細(xì)胞上則缺如。陣發(fā)性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnalhemohlobulinuria,PNH）病人的紅細(xì)胞上也缺少DAF，并以缺乏程度將該病分為三個(gè)型。PNH病人的紅細(xì)胞對補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血作用高度敏感，就是由于紅細(xì)胞上缺乏DAF及基它含GPI錨的分子而引起的。DAF帶有Cromer抗原。極少數(shù)稱之為Inaba或IFC缺乏的Cromer相關(guān)抗原的個(gè)體也缺乏DAF。

DAF生物學(xué)活性及生理功能已虱到充分證實(shí)。它可保護(hù)宿主細(xì)胞免遭補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解破壞。其作用機(jī)理是，DAF不僅可阻止經(jīng)典或替代途徑C3和C5轉(zhuǎn)化酶的裝配，并且可通過誘導(dǎo)催化單位C2a或Bb的快速解離而使已形成的C4、C5轉(zhuǎn)化酶失去穩(wěn)定性，從而抑制補(bǔ)體攻擊單位的活化（圖5-15）。DAF的這種抑制作用**于直接結(jié)合在細(xì)胞上的C3、C5轉(zhuǎn)化酶，也即DAF不抑制靶細(xì)胞上正常的補(bǔ)體激活劑如微生物和**復(fù)合物。但DAF不能作為I因子裂解C3b和C4b的輔因子而發(fā)揮作用。另外，DAF雖不能阻止C2和B因子（分別通過與C4b或C3b結(jié)合）與細(xì)胞的*初結(jié)合，但卻可使C2a或Bb由它們結(jié)合的部位解離出來，以而阻止C3轉(zhuǎn)化酶的裝配。

DAF抑制替代途徑中C3轉(zhuǎn)化酶形成的的機(jī)理

圖5-15　DAF抑制替代途徑中C3轉(zhuǎn)化酶形成的的機(jī)理

編碼人DAF的基因位于第1號(hào)染色體的長臂上32區(qū)一個(gè)800kb片段內(nèi)，與其它幾種補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)劑（RCA）的基因緊密連鎖，排列順序依次為：MCP-CR1-CR2-DAF-C4bp。其中DAF基因的長度約為C4bp。其中DAF基因的長度約為35kb，以限制性酶譜分析表明為一單拷貝基因。在DAF基因的非編碼區(qū)還有3個(gè)限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）結(jié)構(gòu)，兩個(gè)為HindⅢ酶切位點(diǎn)，1個(gè)為Bamh Ⅰ酶切位點(diǎn)。DAF的cDNA已克隆成功，并進(jìn)行了核苷酸和氨基酸序列分析。關(guān)于DAf cDNA和膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)見圖5-16。DAF的cDNA結(jié)構(gòu)從5`端開始依次為：信號(hào)肽區(qū)、四個(gè)SCR（長度1143bp）、富含絲氨酸與蘇氨酸（S/T）的區(qū)（約70個(gè)氨基酸）及疏水區(qū)，*后終止于3`端的poly（A）。由cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列得出DAF蛋白由381個(gè)氨基酸所組成，包括34個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，富含S/T的區(qū)為DAF中大多數(shù)延伸的O-連接的糖基化部位。SCR中有1上N-連接的的糖基化部位。C末端的疏水區(qū)在翻譯后被糖磷脂所取代，為DAF分子與細(xì)胞膜相結(jié)合的部位。

DAF cDNA和其膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)